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스테로이드 프로파일을 위한 시료 전처리 기술



최만호(KIST 분자인식연구센터)

질량분석법 기반 스테로이드 분석
  항원-항체 반응을 활용하여 생체분자를 분석하는 효소-면역측정법(enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA)은 고감도의 분석결과를 제공함과 동시에 임상에서의 범용성을 보이고 있다. 하지만, 생체 내에 존재하는 스테로이드 호르몬의 경우, 해리된 상태뿐만 아니라 glucuronic acid 또는 sulfuric acid와 포합체 형태로 존재하게 되며, 이러한 포합체들과 해리상태의 스테로이드를 선별하여 각각의 농도를 측정하기 위해서, 2014년 미국내분비학회에서는 질량분석법(mass spectrometry; MS)에 의한 고신뢰성 분석기술을 제안하게 되었다.
  이후 많은 기초 및 임상연구자들이 질량분석법을 도입하여 스테로이드 호르몬 뿐만 아니라 다양한 생체화합물을 측정하고 있으나, 본 원고에서는 생체 내 극미량으로 존재하는 스테로이드들을 대량으로 존재하는 방해물질로부터 정확하게 구분하여 그 양을 측정할 수 있는 시료전처리에 대한 중요성을 소개함으로써 질량분석법의 활용성을 극대화하기 위한 정보를 제공하고자 한다.
기체크로마토그래피-질량분석법
  콜레스테롤로부터 대사되는 스테로이드 호르몬들은 모두 3개의 육각고리와 1개의 오각고리가 연결된 화합물의 형태를 기본 골격으로 하고 있으며, 다양한 위치에 hydroxyl, carboxyl 및 carbonyl ketone과 같은 기능기들이 존재함으로써 서로 다른 극성을 나타나게 된다. 따라서, 테스토스테론과 및 콜레스테롤과 같이 상대적으로 비극성인 화합물들은 기체크로마토그래피(gas chromatography: GC)를 활용하여 기체상태에서 분리할 수 있으며, 알도스테론과 담즙산과 같은 극성이 높은 스테로이드들의 경우에는 극성 유기용매를 사용하여 액체크로마토그래피(liquid chromatography; LC)를 기반으로 분석하는 것이 효과적이다(그림 1).
  일반적으로 크로마토그래피 분해능은 이동 및 확산속도가 높은 기체의 성질을 이용하여 길이가 긴 모세관을 사용하는 GC가 우수하므로 동시 다성분 분석을 위한 프로파일링 분석에서 주로 사용되지만, 화합물의 휘발성과 고온에서의 안정성을 위한 화학적 유도체화가 필수적이므로 시료 전처리에 보다 전문성이 요구된다.
액체크로마토그래피-질량분석법
  LC를 기반으로 스테로이드 화합물을 분석하는 경우, 물 또는 유기용매에 대한 용해도가 우선적으로 고려되므로, GC에 비해 더 광범위한 화합물들을 분석할 수 있는 장점이 있으며, 또한 유도체 과정이 필요하지 않으므로 시료 전처리 시간이 단축될 수 있다. 특히, glucocorticoids 및 mineralocorticoids를 포함하는 부신호르몬들의 대사변화를 측정하고자 하는 경우, 상대적으로 높은 극성에 의하여 LC에 의한 분석이 용이하다(그림 2).


  하지만, single cell 및 극미량의 임상시료로부터 스테로이드 호르몬을 측정하고자 하는 경우, LC-MS를 사용하는 경우에도 기존 sub-ng/mL 농도의 검출한계를 sub-pg/mL 수준까지 향상시키기 위하여 유도체화를 수행하기도 하는데, 사춘기 성호르몬의 역할을 규명하기 위한 연구에서, 성선자극호르몬 분비호르몬(Gonadotropin Releasing Hormone; GnRH)을 knock-out시킨 마우스모델에서 극미량을 존재하는 성호르몬을 검출할 수 있었다.
  최근, 크기가 작은 LC 컬럼충진제를 사용하는 UPLC (ultra-performance LC)의 출현으로 인하여, 특수한 초고압 장비가 아닌 일반 LC pumping system으로도 고유속/고분해능의 분석기술이 발전하고 있으나, 스테로이드 분석의 경우, 유사한 화합물의 구조 및 유사한 극성의 시료 내 방해물질을 제거하기 위해서는 고유속 조건에서 단시간 내에 화합물을 측정하기보다는 고분해능 조건에서 다양한 화합물들을 선별하여 분리해낼 수 있는 기술이 필요하다. 그림 3(left)와 같이 소변 내 testosterone을 LC-MS로 단시간에 분석하고자 하는 경우, 11-keto-dihydroteststerone (11-keto-DHT)와 동시에 용출되어 과량의 정량결과를 얻게 된다. 질량분석법을 사용하여 정량을 하는 방법으로, 주로 selected-ion monitoring (SIM) 또는 tandem mass spectrometry (MS/MS) 검출법이 사용되어, testosterone을 검출하기 위한 이온값만을 모니터링 하는 경우에도 실제로는 LC 컬럼에 두 가지 화합물이 동시에 용출되어 baseline에 영향을 미치게 된다.


고체상추출법
  실제로 생체 시료 내의 다양한 화합물들 중에서 분석 대상물질인 대부분의 스테로이드들은 극히 낮은 농도로 존재하게 되므로, GC-MS 또는 LC-MS를 활용하여 이들을 분석하는 경우, 정제와 농축 과정이 필수적이다. 일반적으로 크로마토그래피를 기반으로 질량분석기에 의한 검출 전 과정에서 많은 화합물이 분리되기는 하지만, 여전히 과량으로 존재하는 물리-화학적 성질이 유사한 생체 내 화합물들에 의해 GC 및 LC에 의한 분리가 방해를 받게 된다. 따라서, 시료의 복잡성을 낮춰주는 것이 GC-MS 또는 LC-MS에 의한 정량분석에서 매우 중요하므로, 서로 다른 극성의 용매를 사용하여 분리하는 액체-액체추출법과 더불어 최근에는 고정상추출법(solid-phase extraction; SPE)이 광범위하게 사용되고 있다.
  소변 및 혈액과 같은 생체 시료 내 존재하는 극미량의 스테로이드를 분석하는 경우, SPE 재질로서 주로 규조토 또는 크로마토그래피에서 가장 많이 사용되는 C18 물질이 주로 사용되는데, 최근에는 생체 내 화합물들의 다양한 극성을 고려하여 양쪽성 특성을 지니는 Oasis HLB™을 광범위하게 사용하고 있다. 이러한 방법들은 대부분의 스테로이드 화합물들을 선택적으로 추출하는데 매우 유용하고 사용되고 있으니, cholesterol을 포함하여 비극성을 나타내는 sterol류들의 분석에서는 여전히 크로마토그래피에서 다량의 인지질 등에 의해 방해를 받게 된다(그림 3, right). 따라서, 단백질 및 긴 사슬의 phospholipids와 선택적으로 결합을 할 수 있는 hybrid 형태의 SPE를 사용하여, sterol들로부터 단백질과 phospholipid들을 제거하게 된다. 또 다른 형태로 최근 개발된 supported liquid extraction (SLE)방법은 긴 사슬의 비극성이면서 또한 극성기능기를 포함하고 있는 phospholipids로부터 상대적으로 극성이면서 유기용매에 대한 용해도가 다른 스테로이드 화합물들을 분리하는데 효과적으로 사용되고 있다.
스테로이드 분석기술 전망
  최근 10여년 동안 질량분석법에 의한 임상시료 내 스테로이드 분석에 대한 비약적인 발전에도 불구하고, 실험실 간의 표준화 및 결과의 유사성이 결여되어 실제 임상현장에서의 질량분석법 활용은 아직 초기단계에 머물러 있다. 가장 중요한 것은 시료 내 방해물질들을 효과적으로 제거하지 않은 상태에서 질량분석기라는 장비에 의존하여 분리 및 분석을 수행하는데 그 원인이 있다. 특히, tandem mass spectrometry (MS/MS)등의 질량분석방법에 의해 스테로이드들로부터 방해물질을 쉽게 분리할 수 있다는 점과 고분해능 질량분석기를 활용하여 유사한 화학구조식 및 분자량의 화합물을 구분할 수 있다는 의견이 존재한다. 하지만, 고도의 검출기능을 나타내는 질량분석기를 효과적으로 사용하여 재현성 있는 결과를 얻기 위해서 가장 중요한 것이 시료의 정제임을 다시 한 번 강조하고 싶다.
  이러한 고기능성 장비를 임상현장에서 요구되는 high-throughput 스크리닝 기술로써 사용하기 위해서는 가능한 많은 정보를 질량분석법으로 얻은 후, 이를 기반으로 효과적인 바이오마커를 발굴하여 가능한 적은 양의 시료로부터 동일한 결과를 얻을 수 있어야 한다. 정해진 시간에 다량의 임상시료를 분석하기 위해서는 시료 전처리 과정 등이 자동화되어야 하는데, 이 경우 한사람으로부터 대량의 시료를 채취하여 사용하기에는 그 적용범위가 충분하지 않을 수 있다. 따라서 최근에는 혈흔 및 타액과 같은 비침습적이거나 극미량의 혈액 및 조직 시료로부터 스테로이드를 정량적으로 측정하는 질량분석법 기반 기술과 더불어 간단한 형태의 광학기반 키트의 개발이 활발히 진행되고 있다.
참고문헌

1. M.H. Choi, B.C. Chung, Bringing GC-MS profiling of steroids into clinical applications. Mass Spectrometry Reviews, 34, 219-236 (2015)

2. J.H. Kim, G.C. Han, J.Y. Seo, I. Park, W. Park, H.W. Jeong et al., Sex hormones establish a reserve pool of adult muscle stem cells. Nature Cell Biology, 18, 930-940 (2016)

3. H.H. Son, J.Y. Moon, H.S. Seo, H.H. Kim, B.C. Chung, M.H. Choi, High-temperature GC-MS-based serum cholesterol signatures may reveal sex differences in vasospastic angina. Journal of Lipid Research, 55, 155-162 (2014)

4. J.Y. Moon, H.S. Lee, J.H. Kim, J.H. Lee, M.H. Choi, Supported liquid extraction to gas chromatography-selective mass spectrometric scan modes for serum steroid profiling. Analytica Chimica Acta, 1037, 281-292 (2018)

5. S.H. Lee, D. Lee, M.H. Choi, J.H. Son, M. Seo, Highly sensitive and selective detection of steroid hormones using terahertz molecule-specific sensors. Analytical Chemistry, 91, 6844-6849 (2019)

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